Expressão gênica diferencial em úbere extracorpóreo de vacas mestiças Holandês-Zebu infectado por Streptococcus agalactiae

Abstract

A mastite é responsável por grandes perdas econômicas na bovinocultura leiteira e necessita de maior compreensão de suas bases genéticas para que métodos de melhoramento genético possam ser desenvolvidos. Neste sentido, estudos de expressão gênica têm sido empregados. Portanto, os objetivos deste trabalho foram: 1. Detectar, por meio de três métodos computacionais distintos, a expressão gênica diferencial de dados obtidos por sequenciamento de RNA extraído de glândula mamária mantida em um sistema extracorpóreo de bovinos de leite mestiços Holandês-Zebu e infectada experimentalmente com Streptococcus agalactiae; 2. Estudar o perfil de expressão do total de genes identificados e aqueles comuns aos três métodos relacionados ao desenvolvimento da mastite, a fim de contribuir para melhor entendimento de processos biológicos, de componente celular e função molecular e vias biológicas envolvidas com a expressão desta característica. Quatro vacas foram abatidas e os úberes foram colhidos, perfundidos e inoculados com S. agalactiae. Para cada úbere, dois quartos foram inoculados (anterior esquerdo - AE; e posterior esquerdo - PE) e dois quartos foram utilizados como controle (anterior direito - AD; e posterior direito - PD). Biópsias foram feitas do tecido alveolar nos tempos 0 e 3 horas após a perfusão do tecido. O RNA das amostras foi extraído e sequenciado com a plataforma HiSeq2000 (Illumina). A partir das leituras obtidas os transcritos foram montados utilizando como referência a anotação do genoma bovino UMD 3.1 e então foram avaliadas quanto à sua expressão diferencial e funcionalidade. Métodos que assumem distribuição binomial negativa executados pelos métodos computacionais edgeR e baySeq e o método que assume distribuição beta binomial negativa executado pelo Cuffdiff, foram utilizados para análise de expressão gênica diferencial. Foram identificados 5.158 genes provenientes da união dos resultados obtidos com os três métodos computacionais. Esses genes foram investigados pela plataforma DAVID revelando o enriquecimento de termos de ontologia gênica, dentre os quais destacaram-se os processos de resposta a estímulos, sistema imune e processos apoptóticos. O perfil de genes diferencialmente expressos em amostras afetadas foi associado com a diferenciação, proliferação, migração e apoptose celular, desempenhando importante papel no local da inflamação por células do sistema imune, além de ativar vias de sinalização relacionadas ao sistema imune que são importantes nas primeiras três horas de infecção. Foram identificados apenas 122 genes com expressão diferencial em comum pelos três métodos utilizados. A restrição causada pelo uso da intersecção dos resultados obtidos com os três métodos não se mostrou adequada para realizar o enriquecimento funcional pois muitos genes de interesse foram desconsiderados e perdeu-se suporte estatístico nas análises de enriquecimento funcional. Assim, sugerimos que para esse tipo de estudo é mais adequado a utilização dos resultados de um dos métodos ou a união dos resultados dos três métodos. Este estudo permitiu maior entendimento das bases genéticas do desenvolvimento da mastite em úbere extracorpóreo de bovinos leiteiros mestiços holandês-Zebu, infectado experimentalmente por S. agalactiae, durante as primeiras horas de infecção.

Mastitis is responsible for huge economic losses in dairy cattle production which requires a better understanding of its genetic bases in order that genetic breeding methods could be developed. Therefore, some gene expression studies have been developed. The aims of this study were: 1. To detect, through three different computational methods, the differential gene expression data obtained by RNA sequencing from mammary glands of Holstein-Zebu crossbred dairy cattle, kept in an extracorporeal system and experimentally infected with Streptococcus agaclatiae; 2. To study the total gene expression profile and those genes common to the three methods, related with mastitis, in order to contribute to a better understanding of biological processes, cellular components, molecular functions and metabolic pathways related with the expression of this trait. Four cows were slaughtered and its udders were perfused and inoculated with S. agalactiae. For each udder, 2/4 were inoculated (front left - AE, and rear left - PE) and 2/4 were used as control (front right - AD, and rear right - PD). Biopsies were obtained from the alveolar tissue at 0 and 3 hours after the tissue perfusion. The RNA sample was extracted and sequenced with HiSeq 2000 platform (Illumina). From the reads obtained transcripts were assembled using as the reference the bovine genome annotation UMD 3.1, and then were evaluated for differential expression and functionality. Methods that assumes negative binomial distribution performed by edgeR and baySeq and the method that assumes beta negative binomial distribution performed by Cuffdiff were used for differential gene expression analysis. From the union of the results obtained with all computational methods, a total of 5,158 genes were identified. These genes were investigated by DAVID platform showing the enrichment of gene ontology terms, which were highlighted the response processes stimuli, immune response and apoptotic processes. The profile of differentially expressed genes identified in the affected samples was associated with differentiation, proliferation, migration and apoptosis, playing a major role in the inflammation site by immune system cells and in the activation of signaling pathways related to the immune system, which are important in the early three hours of infection. Only 122 differentially expressed genes were identified in common by the three methods. The restriction caused by the use of the intersection of the results obtained with the three methods was not interesting to perform functional enrichment analysis because there is loss of many interesting genes and the functional enrichment analysis has no statistical support. Thus, for this kind of study, we suggest that could be most appropriate the use of the results obtained with one method or the union of the results obtained with more than one method. This study allowed a better understanding of the genetic basis of mastitis developing in extracorporeal udder of Holstein-Zebu crossbred dairy cattle, during the early hours of experimentally infection by S. agalactiae.