Estudos estruturais com a importina-σ de mamíferos e peptídeos de sequências de localização nuclear (NLS) de proteínas envolvidas no reparo de DNA

Abstract

DNA damage can occur by endogenous and exogenous genotoxic agents, which may promote instability of the genome and directly lead to diseases such as cancer, neurological disorders, immunodeficiencies and even premature aging. Helping in the maintenance of the stability, the cells display a number of DNA repair pathways, which carry out the process in multiple steps to resolve specific DNA damage, and maintain the integrity of the genome. The nuclear import is a pre-requisite for the functions of DNA repair proteins and, among the mechanisms responsible for regulation of nuclear import, the classical pathway constituted by the heterodimer importin-α / β is a major shift mechanisms. Importin-β (Impβ) acts as the carrier while the importin α-(Impα) acts as an adapter recognizing the nuclear localization sequence (NLS) present in proteins that have function into the nucleus.This work concerns specifically the structural studies of complexes with Imp and NLSs peptides from proteins related to DNA repair using crystallographic techniques and binding assays by isotermal titration calorimetry technique (ITC). The expression and purification of Mus musculus Impα truncated at its N-terminal portion was performed, as well as co-crystallization with Impα NLSs peptides of proteins related to DNA repair, the corresponding sequences MLH1, PMS2, XPG1 and XPG2. Peptides mutated in key regions of nuclear recognition for MLH1 and PMS2 peptides were also selected for this project. X-ray diffraction data collected from crystals were obtained and processed in the range of 2.0-2.8 Å resolution. With these results, the structures containing cNLSs MLH1, PMS2, XPG1 and XPG2 were elucidated. The MutLα complex proteins, MLH1 and PMS2, related to the mismatch repair (MMR), bound to the Impα similarly to the T antigen NLS of SV40 in the major binding site. ITC experiments corroborate the crystallographic results, which suggest that both NLSs are classic...

Danos no DNA, podem ocorrer tanto por agentes genotóxicos endógenos quanto agentes exógenos, que podem promover a instabilidade do genoma e levar diretamente a doenças, como por exemplo, o câncer, alterações neurológicas, imunodeficiências e envelhecimento prematuro. Auxiliando na manutenção da estabilidade, as células apresentam uma série de vias de reparo de DNA, as quais realizam o processo em múltiplas etapas para resolver lesões específicas no DNA e manter a integridade do genoma. A importação nuclear é um pré-requisito para as funções das proteínas de reparo do DNA e dentre os mecanismos responsáveis pela regulação da importação nuclear, a via clássica constituída pelo heterodímero Importina-α/β é um dos principais mecanismos de deslocamento. A Importina-β (Impβ) atua como o transportador enquanto a Importina-α (Impα) atua como adaptador, reconhecendo as sequências de localização nuclear (NLS) presentes nas proteínas que possuem função no núcleo. Esse trabalho trata especificamente dos estudos estruturais de complexos da Impα peptídeos NLSs de proteínas relacionadas ao reparo de DNA utilizando técnicas de cristalografia e ensaios de afinidade pela técnica de calorimetria de titulação isotérmica (ITC). A expressão e purificação da Impα de Mus musculus truncada em sua porção N-terminal foi realizada, bem como a co-cristalização da Impα peptídeos NLSs de proteínas relacionadas ao reparo de DNA, correspondentes as sequências MLH1, PMS2, XPG1 e XPG2. Peptídeos mutados em regiões importantes de reconhecimento nuclear para os peptídeos MLH1 e PMS2 também foram selecionados para o desenvolvimento deste projeto. Dados de difração de raios-X foram coletados dos cristais obtidos e processados no intervalo de 2,0-2,8 Å de resolução. Com esses resultados, as estruturas contendo cNLSs MLH1, PMS2, XPG1 e XPG2 foram elucidadas. As proteínas do complexo MutLα, a MLH1 e...