Variabilidade genética em isolados de Curtobacterium flaccumfaciens

Abstract

A cultura do feijoeiro está sujeita à incidência de várias doenças que acarretam perdas significativas na produção, dentre as quais encontra-se a murcha-de-curtobacterium ou murcha bacteriana, causada por Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (Cff). Atualmente a murcha-de-curtobacterium tem se constituído em um novo problema para a cultura do feijoeiro em várias regiões brasileiras. A resistência genética tem sido o meio mais eficiente no controle da doença, porém a possibilidade da existência de variabilidade genética presente em isolados de Cff, pode ser uma conseqüência maléfica ao melhoramento visando a obtenção de cultivares de feijoeiro resistentes, especialmente na estabilidade e durabilidade da resistência. Neste sentido, o presente trabalho teve como objetivo o estudo da variabilidade genética de 26 isolados de Curtobacterium flaccumfaciens, 20 dos quais provenientes de feijoeiro (Cff), coletados em diferentes regiões do Brasil, quatro provenientes de coleções internacionais (Cff) e dois endofíticos de citros (C. flaccumfaciens). Foram utilizados dois pares de oligonucleotídeos, CffFOR2-CffREV4 e CF4-CF5, avaliando-se na especificidade em reação de PCR, para a caracterização dos 26 isolados. No estudo da variabilidade genética, utilizou-se da técnica rep-PCR e os iniciadores REP, ERIC e BOX. A partir do padrão eletroforético gerado pela amplificação dessas seqüências repetitivas no DNA genômico dos 26 isolados bacterianos, foram realizadas análises pertinentes (UPGMA SM) e obtenção de um dendograma. Considerando-se um índice de similaridade de 75%, os isolados foram distribuídos em quatro grupos distintos. Os isolados de Cff provenientes do Paraná e DF foram separados em grupos diferentes, enquanto que isolados endofíticos de citros não formaram um grupamento distinto dos de feijoeiro. Os isolados procedentes do Estados de São Paulo mostraram-se geneticamente heterogêneos, alguns se agruparam com o isolado de USA, Santa Catarina e de citros, enquanto outros agruparam-se com isolados provenientes da França e Paraná. A avaliação da especificidade dos dois pares de oligonucleotídeos, mostrou que os oligonucleotídeos CffFOR2-CffREV4 detectaram todos os 26 isolados. Os oligonucleotídeos CF4-CF5 apresentaram menor especificidade não detectando dois isolados de Cff de feijoeiro (2928) e (2936) e os isolados endofíticos de citros. Portanto como ferramenta para detecção de Cff em feijoeiro os oligonucleotídeos CffFOR2-CffREV4 revelaram ser os mais indicados.

The bean crop is exposed to many diseases that lead to significant losses, such as the bacterial wilt of common bean caused by Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (Cff). Currently, the bacterial wilt of common bean has been a new problem for the bean crops in several Brazilian regions. The genetic resistance has been the most efficient approach for disease control; however, the possible existence of genetic variability in Cff isolates may be a harmful consequence to the plant improvement especially in relation to the resistance stability and durability. For this reason, this study aimed the evaluation of the genetic variability of 26 Curtobacterium flaccumfaciens isolates, 20 isolates are from bean plants (Cff) collected in different Brazilian regions, four isolates are from international collections (Cff) and two isolates are from citrus endophytic community (C. flaccumfaciens). Two pairs of primers (CffFOR2-CffREV4 and CF4-CF5) were evaluated for its specificity in PCR reaction in the characterization of the 26 isolates studied. In the genetic variability evaluation, the rep-PCR technique with the REP, ERIC and BOX primers was used. From the electrophoresis pattern generated by the amplification of these repetitive sequences in the genomic DNA of the 26 bacterial isolates, a pertinent analysis (UPGMA SM) and a dendogram were performed. Considering a 75% similarity index, the isolates were distributed into four distinct groups. The Cff isolates from Paraná and Distrito Federal were separated in distinct groups, while citrus plant endophytic isolates did not form a distinct group from the bean plant ones. The isolates from São Paulo were genetically heterogeneous; and some of them were grouped with the USA, Santa Catarina and citrus plant isolates, while others were grouped with the ones from France and Paraná. The specificity evaluation of the two pairs of primers (CffFOR2-CffREV4 and CF4-CF5) used in the identification of Cff isolates in bean plant and citrus endophytic Curtobacterium flaccumfaciens isolates showed that the CffFOR2-CffREV4 combination was highly specific in the identification for the 26 isolates. The CF4-CF5 primers showed less specificity for two Cff isolateds in bean plant (2928) and (2936) and for the citrus endophytic isolates. Therefore, as an auxiliary tool in the Cff identification in bean plant, the primers CffFOR2-CffREV4 are the best indication.