Estudo de isoenzimas de metabolismo de carboidratos e clonagem e expressão da enolase de Xylella fastidiosa

Abstract

Muitas das questões relacionadas a como Xylella fastidiosa vive num ambiente cuja concentração de nutrientes é baixa, e como e porquê ela forma agregados nos vasos do xilema, devem estar relacionados com seu metabolismo. O seqüenciamento deste organismo forneceu informações para serem aplicadas em estudos genéticos funcionais, visando à elucidação da funcionalidade de vias metabólicas que possam estar intimamente ligadas à etiologia do amarelinho. O presente estudo foi conduzido com o objetivo de verificar a funcionalidade da via Glicolítica de X. fastidiosa através de estudo das isoenzimas fosfoglicose isomerase, aldolase ou gliceraldeído-3-fosfato liase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase e piruvato quinase presentes na via Glicolítica e a glicose 6-fosfato desidrogenase presente na Entner-Doudoroff, bem como a clonagem, expressão e a determinação da atividade da enolase. O gene da enolase é uma das 35 ORFs anotadas no cosmídeo 02F10, denominada XF1291. Estes estudos sugerem que a bactéria X. fastidiosa não utiliza a via Glicolítica no metabolismo de carboidratos, inferindo assim no elevado tempo de duplicação deste fitopatógeno. As atividades enzimáticas da enolase recombinante, da enolase nativa e das isoenzimas aldolase e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase não foram detectadas, sugerindo que a X. fastidiosa utiliza a via Entner-Doudoroff para a formação de piruvato. São apresentadas evidências de que a regulação gênica e a presença de isoformas, com propriedades regulatórias diferentes, podem dificultar a compreensão do metabolismo de carboidratos em X. fastidiosa.

Many of the questions related to how Xylella fastidiosa lives in an environmental with low concentration of nutrients, and the reason why she forms aggregates in xylem vessels should be related with its metabolism. However, the sequencing this organism provided information to be applied in functional genetic studies. These studies focus on elucidating the functionality of metabolic pathways that might be intimately involved in amarelinho etiology. The objective of this study was to verify the functionality of the Glycolytic pathways by studying the isozymes phosphoglucose isomerase, aldolase or glyceraldehyde-3-phosphato-lyase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and pyruvate kinase in the Glycolytic pathway and glucose-6-phosphate dehydrogenase in Entner-Doudoroff pathway, as well as the cloning and expression of enolase and determination of its activity. The enolase gene is one of 35 ORFs annoted in 02F10 cosmid and denominated XF 1291. These studies suggested that X. fastidiosa bacterium does not use the Glycolitic pathway in the metabolism of carbohydrates, which might explain the long time of duplication presented by this phytopathogen. The enzymatic activities of recombinant enolase, native enolase and isozymes aldolase and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase have not been detected, suggesting that X. fastidiosa uses the Entner-Doudoroff pathway to produce pyruvate. Evidences are presented that the regulation of genes and the presence of isoforms with different properties of regulation can make it difficult to understand the metabolism of carbohydrates in X. fastidiosa.