Identificação de genes cry1 em isolados de Bacillus thuringiensis e expressão do gene cry1la em Escherichia coli visando o controle de pragas da cultura algodoeira

Abstract

O controle de pragas da cultura algodoeira pode ser feito utilizando proteínas Cry de Bacillus thuringiensis e para tal, o presente trabalho testou a atividade inseticida de novos isolados de B. thuringiensis frente a larvas neonatas de Spodoptera frugiperda e Anthonomus grandis, resultando em diversos níveis de mortalidade que foram associados a oito diferentes combinações de genes cryl identificados por PCR. O gene crylla (lepidóptero e coleóptero específico) esteve presente na maioria dos isolados, assim como nas linhagens padrões e principalmente nos isolados de maior efetividade para as duas pragas. A partir deste fato, a atividade inseticida de uma nova proteína Cry1 la foi avaliada frente a larvas neonatas de S. frugipercla e A. grandis. O gene crylla completo, previamente obtido por PCR com oligonucleotídeos iniciadores desenhados a partir do gene seqüenciado, foi clonado no vetor pET28a(+), introduzido em Escherichia cor, BL21(DE3) e expresso por indução com IPTG, confirmando a expressão da proteína Cry1la, com peso molecular de aproximadamente 81 kDa. Os resultados demonstraram a eficiência do sistema bacteriano na expressão da proteína Cry1 la de B. thuringiensis, a qual foi, posteriormente, utilizada nos bioensaios quantitativos contra larvas de S. frugiperda e A. grandis, resultando em uma proteína altamente tóxica às duas espécies, característica importante para obtenção de plantas transgênicas de algodão resistentes a estas pragas

The control af cotton pests may be done by using Bacillus thuringiensis Cry proteins. For this purpose, the present work tested the insecticidal activity of new B. thutingiensis isolates, in neonate larvae of Spodoptera frugiperda and Anthonomus grandis, resulting in different mortality leveis that were associated to eight different combinations of cry 1 genes identified by PCR. The cry1la gene (specific Lepidoptera and Coleoptera) was present in most of the isolates, as well as in the standard strains and mainly in the isolates with higher affectivity for both pests. Considering this, the insecticidal activity of a new Cryl la protein was evaluated against neonate larvae of S. frugiperda and A. grandis. The complete cry1la gene, previously obtained by PCR with oligonucleotide primers that were drawn based on the sequenced gene, was cloned in the vector pET28a(+), introduced in Eschetichia coli BL21(0E3) and expressed by induction with IPTG, confirming the expression of the Cry1la protein, with molecular weight of approximately 81 kDa. The results demonstrated the bacterial system efficiency on the expression of B. thuringiensis Cry1la protein, which was posteriorly, used on the quantitative bioassays against S. frugipercla and A. grandis larvae, resulting in an extremely toxic protein for both species. This characteristic is exceptionally important for obtaining transgenic cotton plants resistant to these pests